那么由于我前面讲到了，我们所选择的材料是有限的，即使现在获得如果是三倍或者是双单倍材料，如果用单一的我们现在常用的全基因组鸟枪法去研究的话，仍然还能达到全基因组的组装。因此，现在采用的策略基本上采用的是鸟枪法的话加上BAC to BAC这种基本的策略，这样两个结合起来以后可以使我们现有的测试可以达到一个圆满的组装，对一些经验重视。但是这个工作虽然我们现在只做了一部分，但是中间取得数据非常有效，现在我们这个课题组，包括其他课题组所研究的都是用这些基本的数据作为它的一个材料进行研究。 那么这是一张框图，这是目前大量采用的测序的一种基本的方案，还有深度测序，不同的特定方法，主要是鸟枪法和鸟枪BAC to BAC这种方式。有个深度的，针对不同的材料采用的一些策略。 第四个方面是转录组，是转录组水平的进行分布测序。这个对我们研究次生代谢，特别是结构和调控基因又提供了一个便捷的途径，因为前面讲到基因组现在我们没有出来，即使出来以后要组装出来进行测试以后再后面研究，还有一个漫长的过程。而转录组现在相对容易一些，我们现在采用这一套，是我们国内茶叶界，包括国外茶叶研究通常用的方法就是转录组。那么这个颜色在整体的细胞水平，在转录这个层次上面进行。那么这个研究可能也表达出了也测序了，这些工艺现在大家可能在网络在文章上面经常遇到作为一些基本的技术，所以我就不介绍了。 那么这个技术是1994年，日本首先构建了茶树的cDNA文库，这个为我们今后的使用其重要的基因奠定了基础。那么国内实际是我们中茶所的陈亮研究员用我们国内的一些品种进行了茶树新梢的幼根cDNA文库的构建，随后我们其他研究课题组也都对这一类进行了转录组方式进行研究，获得了大量的功能基因。目前，到2012年的4月，在NCBI上登录了一些…，ESTs这种基本的序列达到两万五千多个，这中间涵盖着大量我们说的次生代谢的一些调节酶。 这是我们实验室在BMC发表的一个就是经过转录组研究对不同代谢环境，这个是发生的一些西方的一个分布，这个看得很清楚，都是多基因的。我们前面讲到了经过基因组也好、转录组也好，只是为我们提供一个信息平台，筛选一些关键功能基因这个平台。当然现在我们随着研究深度不断加大以后，从我们对类黄酮的研究来说已经预测了63个基因的一些表达法，其中34个我们已经把它全场克隆出来，其中9个功能得到验证，10个正在研究它的启动出来。 这张图是我们课题组做的一个基本的，画红的部分，红线部分就是我们现在所关注这部分的功能就是结构和调控基因，主要分布在这么一个空间和这么一个红线内，这是我们所关注的。涉及到就是前面讲到的黄酮类代谢的三大途径，都在这个中间维持。 那么这个是后期的某一个家族，这是我们讲的UGT这个基因家族，就是这么一个家族，我们现在筛选了六个侯选基因，目前功能正在研究，主要分布在这个部分通过。这个是对转录因子进行的一些调控基因的家族的分析，特别是侯选的9个基因，…公布4在这么一个区域，这也是我们目前做的就是对不同的转录组它的水平上筛选的一些。

第五个，给大家汇报一下蛋白质组学。蛋白质组学是近年来大家做得也是比较集中的一个方向，这是1995年提出来的实际上它主要是在蛋白质水平上，前面讲的基因水平、转录组水平到蛋白水平这样更直接一些，那么它所涵盖的主要是全套蛋白质，跟我们前面讲的代谢不一样，是全部的次生代谢产物，这个地方是全部的蛋白质。那么由于是全部的蛋白质，所以后面对它的分析就带来一个问题就是你用什么样的技术取得这些全部的蛋白质是一个关键的瓶颈问题。现在我们的这个技术已经发达，并且双向的电泳、质谱分析现在大量跟进为我们这个研究奠定一个最基本的前提条件。这是大家都很清楚的，一些飞行的时间质谱的分析，包括一些电喷雾的一些质谱，现在用的都比较多的。 这里我举例，这是我们课题组做不同儿茶素代谢水平的差异细胞系的蛋白质组学，通过双电融合取得不同的细胞系和我们经过照光以后处理的，将来透过它的…差异点，所以我们标注的这些都是它们差异比较大的，再把这些蛋白质拿出来以后再进一步…看看哪些是关键酶、哪些是调控的，起到一些限速的，这个时候再挖掘。 这个是做了一些氨基酸调控的，这个基因代谢组的，也是这么一个基本策略。这是它的一些方案…的图，做了一些差异蛋白点，在中间把它挖出来以后再进一步深度分析。 尽管现在分析技术也上去了，我们前期也做了一些工作，但是也发现这个蛋白质组学存在很大局限性就是因为它是一个全蛋白的组，因此在中间我们可能很难对它进行定性定量可以得到它的一些构型。特别是要建立大规模、超微量、高通量、全自动筛选方面很难达到，当然现在大家看看做到最后都是经过不同处理、不同材料之间，蛋白质有什么差异，把这个拿出来以后再往下做又进入瓶颈期。当然现在做基本上是要借助于后面可能更高风量、更微量的一些技术才能把它这个丰富蛋白质组学的研究，尽管是一个技术层面的问题。 因此既然是新型的蛋白质组学它有它的存在的问题，我们现在结合起来既有我们现代的组学，也有传统的一些分离纯化技术。这是我们课题组采用一些酶学分析纯化技术结合现在的分析技术，包括后面的数据处理进行对酯型儿茶素，这是困扰我们茶叶界多年的一个瓶颈进行了相关的蛋白和基因的挖掘。从现在的研究看来，这个已经达到一定的进展，按照成果的阶梯进展。 这个研究也是通过一些传统的，大家也看到很清楚有层析、离子交换、亲和，包括分子筛，这个分析了以后是蛋白不断纯化，这是我们纯化出来的蛋白酚。这个蛋白酚经过…以后可以看出来，经过不断的纯化，它的逐渐逐渐…。那么有了它以后，我们再进入质谱鉴定，在一个传统的质谱鉴定，现在基本上把它的结构也给确定出来，确定是。那么有了结构以后我们再用通过体外的一些分化途径把这个酶加进去以后也确定了现在是新的儿茶素合成的一个基本途径模型就出来了，这个通过了三步法把这个两步完成，这三个两步的关键。这个中间涉及到我们夺了一些关键酶，命名的一些关键酶、分解酶，通过这几步就达到酯型儿茶素的一个代谢，基本的方向出来了。

第六个方面是汇报一下关键基因的一些功能验证，前面讲到了通过基因组也好、转录组也好，你找到这些候选基因以后它还不是最终目的，它能不能够在中间表达，能不能体现它的功能这要经过验证。所以现在我们很多都是做到点上面，后面功能验证做得能够达到的现在在我们业界做得不多，现在大家都在这个点子上做进一步的探索。 那么作为茶树中间关键基因的一些功能验证体系，现在利用比较多的是这么几个，一个是原核表达的、酵母表达体系、模式植物表达体系和茶树的遗传转化，下面我分别举一些例子。 比如我们就是原核和酵母表达来验证，我们前面分析这些就是…的合成酶。那么这个通过我们表达以后也证明是能够产生它的融合蛋白，这个纯化的融合蛋白。那么随着这些把我们所有这些功能基本上都逐一逐一进行验证，大的验证。但是问题现在通过这个原核也好、真核也好，很多的表达产生的问题就是它的重组蛋白是能够出量，但是后面检测不到活性，活性菌。现在我们这边的实验室也好，包括其他课题组也好也发现这个问题，蛋白拿到以后很难检测。有一些基因即使在酵母中也能表达了，表达的存活了各个方面的基因都很漂亮，但是后面也很难检测到它的活性。这一点现在是困扰着我们现在研究的，再往深层次走就是一个很关键的问题。这是汇报一下。 第二个是利用模式中，我们这里举例是我们实验课题组是利用烟草。利用烟草，为什么采用这么一个体系呢？我们用它的黄酮类再现一个比较显性表达是在花上面，这也是吸收了国外研究的，它由木素通过烟草来做它的一个基本验证体系。从现在结果看这也是得到国际公认的，这个大家看我们是验证了它的关联基因就是MYB5，这个是作为它的转录因。在这个转化过程中大家看到这个花色有这么一个不同的深浅，这都是发展到一定阶段以后。这个经过测定它的原花青素含量差异非常大，它的花色和它的条带这里也看了不断不断的上调，上调表达的。这个时候我们特定它的表达量也是和这个花色非常相符，因此这个是作为目前我们做…类，特别是对原花色素的代谢调控作为一个很重要的验证体系。 这也是另外一个转化的MYB4，这个作为它的作用很简单，看了以后，作用于烟草以后它就抑制它的增长，这是它的一个典型的特征。就是它一旦转进去以后在烟草的生长过程中长得不好的细胞转进去了，我们这么对照一比随着它的表达它这个增长越差，最后出现一些白化症，一些白化。再到整个的花色上面表现出来非常明显，这个正常的就是紫红色的花，表达程度它抑制它的生长以后就是一种粉白色的，这个非常的明显。我们在在测定它的产物，再测定它中间的基因的表达的强度和蛋白的水平，这样通过它更亲密的验证，这也是不同的这么一个花青素，这是通过这么验证。这个现在也是做得比较成熟了这个体系。 那么这个是利用我们茶树转化的体系做的，这是印度做的。它也是通过过去我们用进行转化以后干扰了茶树咖啡碱的合成。这个体系报道，我看到从生长的情况看，就是有跟对照比相差的，从那边代谢也可以看到和它的整个表达一看是呈现一个非常吻合的这么一种图形。这个就是验证我们一些候选基因或者关键基因的时候，这么几个体系现在都在采用，就是针对不同的代谢产物它的用途可能不太一致。

最后一点介绍一下次生代谢物的代谢工程与合成生物学。我前面讲到我们研究这些次生代谢的整个调控途径也好，研究它的基因也好目的是为了在遗传组织有创新，第二个方面在它的代谢工程上面有所建树。那么代谢工程过去研究比较多的，比如说通过一些悬浮培养，通过一些毛状根，通过一些微生物，这种把我们茶树发现一些功能基因包括转进去以后利用工厂化生产生产一些多酚的、茶氨酸的、咖啡碱的都有，这类报道的比较多，这是我们讲的代谢工程这个角度，比如说微生物转到一些大肠杆菌、酵母里面去进行体外培养，这样可以生成很多的半合成达到这种目的。这是我们课题组现在做的一个就是把一些部分的下游的功能基因转到大肠杆菌里面进行共表达，这样可以实现我们一些简单儿茶素花青素的合成，这是我们做的一些实验，包括一些成果。 最后再给大家介绍一下目前是刚刚兴起的就是合成生物学。这个跟我们前面讲的代谢工程还有一点不一样，这是完全通过人为来进行设计，进行设计的可以分析的。所以我们如果说20世纪经历了一个…到合成这么时代，那么进入…同样就是进入到这么一个合成生物这么一个时代。那么合成生物学在2006年，这个著名科学家Keaslings他当时作为一个梦想就是能够作为这项工程，但是从现在的发展进度看非常快，他这个梦很快就一步一步地来实现。 这里我举几个例子，如果对合成生物学这个基本的核心思想，它就是一种集成和组装，就是你把其他的一些生物就是种子之间的界限打破了，把其他中间一些好的东西你把它合成过来组装在我们现在的物体生物这边，比如说一些微生物这些目标进行人为的合成。这样可以产生一些非天然的天然产物，这个主要是用到我们一些珍惜的物种，比如说讲到紫杉醇，过去采红豆杉，后来是搞代谢工程当然产量太低，表达很低，产量太低。这个也是划不来，现在怎么办？采用这种合成生物学大大提高它的产能。生物学呢，生物学用到这几个天然产物开发，一个是进行化合物的进行筛选可以用到这个高通量的筛选。第二个是有一些结构改造，就是从我们现在产生的一些可能它的药效不是很好的情况下，可以通过一些合成生物学对它产物进行一些甲基化或者是乳剂代谢替代了通过一些其他的功能，包括我们讲的儿茶素、三甲基等都可以用这些合成的东西去完成。那么最后一个就是最大的问题就是合成有异源合成，就是破除种间的一些界限能够达成合成大量的代谢产物。 这个最著名的青蒿酸，这个获得大奖的业界的药。那么这个就是我们前面讲到的Keasling利用这么一个力量组装了这么一个青蒿酸的半合成就是九步非常重要的，他通过不同的来进行组装进行这么一种。那么随后也是美国的科学家对这个紫杉二烯这就是紫杉醇，抗癌药物紫杉醇的合成。现在法国刚公布的一个就是启动了大规模的青蒿素的合成，也是通过这种合成生物学。我想有这些东西的借鉴可能对我们下一步茶叶中间的一些次生代谢产物，特别是对这些验证了它的保健功效的一些次生代谢产物可以引用这些合成生物学的理念来达到体外大规模的生产。这是我引的一些是作为其他的一些来做的，你比如说这个白藜芦醇，这个大家知道现在我们讲了喝的法国葡萄酒为什么这么行销？就是借着这么一个概念，实际上对人体并没有达到这种效果就是喝葡萄酒，因为剂量很低。但是国外通过这么一个合成代谢实现了它的所谓异源的，比如说球型红细菌来组装这么一个TAL编组，通过拟南芥来进入这么一个编组，通过葡萄这么一个编组最后全部组装到酵母里面去。这样达到白藜芦醇的增产，这就是特征生物学一个最基本的，也是一个典型的例子给大家介绍了。 但是这些我们上面谈到了这些工程尽管是目前我们在茶树次生代谢或者是其他代谢一些途径应用了，但是问题是随着组学的发展，随着我们分析技术和数据分析的一些技术发展。这个方面可能研究还会有一些新的气象、新的前景，虽然我们讲随着功能的不断发掘和一些代谢机制能够揭示，也使得我们后面讲到的一些资源，我们也有一些代谢工程研究的，可能会唤醒一个新的活力。好，以上就是不成熟的一些的，给大家做个汇报。谢谢大家！